الخـــلاصة
هدفت هذه الدراسة الى تحديد أنواع جنس Begomovirus وتوابعها المنتشرة على عدد من العوائل النباتية في محافظة كربلاء باستعمال التقنيات الجزيئية الحديثة مثل Polymerase Chain Reaction ، Realtime- Polymerase Chain Reaction واهم هذه الطرق هيNext Generation sequencing
جُمعت عينات مختلفة من نباتات الطماطة من محافظة كربلاء ظهرت عليها اعراض الإصابة الفايروسيه في موسم النمو 2021-2022، استخلص الحامض النووي الـ DNA باستعمال العدة التجارية وطريقة مبتكرة في هذه الدراسة هي استخلاص الحامض النووي بمادة هايبوكلوريت الصوديوم NaClO )القاصر) وطبقت تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل Polymerase Chain Reaction (PCR) باستعمال بادئات تستهدف تشخيص أنواع الجنس الفايروسي Begomovirus بالإضافة الى تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل اللحظي Realtime-PCR (RT-PCR) كما استعملت تقنية الجيل التالي لتحديد التسلسل Next Generation sequencing (NGS) بطريقة Metagenomicsفي تشخيص الفايروسات النباتية المرافقة للنباتات المصابة.
أظهرت النتائج نجاح الطريقة المبتكرة في استخلاص الـDNA الكلي من النباتات المصابة بفايروس TYLCV. وكانت طريقتي الاستخلاص باستعمال محلول هيدروكسيد الصوديوم لوحده او متبوعاً بتطبيق عملية ترسيب الـDNA افضل من طريقة استعمال الماء المقطر فقط او مع تطبيق عملية ترسيب الـDNA ومن جانب اخر حققت العدة التجارية التركيز والنقاوة الأعلى للـDNA المستخلص من النباتات المصابة نفسها.
أظهرت نتائج اختبار العينات النباتية المصابة باستعمال تقنية PCR نجاح زوج البادئات PBL1v2040-F و PAR1c496-R في الارتباط وتضخيم مناطق محددة من الحامض النووي الخاص ببعض انواع الجنس Begomovirus بالمقابل لم تنجح بقية البادئات المستعملة في هذا الاختبار في اكتشاف الفايروسات المحددة.
بالرغم من عدم نجاح عينات الـDNA لمحصولي البطاطا والباميا في أتمام عملية تحديد التسلسل لهما باستعمال تقنية الـNGS الا ان عينات محصول الطماطة نجحت اذ تم الحصول على 52,606,000 سلسلة مقروءات مزدوجة النهايات (Paired ends reads) باطوال 151 قاعدة نايتروجينية والتي تم إنشاؤها للحصول على بيانات الـ Metagenomics.
لقد أظهرت نتائج تقنية الـNGS وجود العديد من المتجاورات المتداخلة المشابهة للتسلسل المرجعي للجينوم الكامل لفايروس تجعد واصفرار أوراق الطماطة Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) اذ غطت تسلسلات الجينوم بأكمله لهذا الفايروس وكان مجموع طول تسلسل هذه المتجاورات 2729 قاعدة نايتروجينية التي نتج عنها جينوم ذو شريط مفرد حلقي احادي الجزء (Monopartite) وذو تنظيم جيني مطابقاً لسلالات هذا الفايروس وذلك باحتوائه على ستة جينات رئيسة مشفرة للبرويتنات الست الرئيسة للفايروس بالإضافة الى المنطقة الوراثية الغير مشفرة مابين الجينات (Intergenic region). ولقد تم أثبات العلاقة الوراثية بين تسلسل الجينوم الكامل لهذا الفايروس مع العديد من سلالات الفايروس نفسه تحديداً السلالات المعتدلة (Mild) وكانت العزلة Tomato yellow leaf curl virus isolate TYLCV-Najaf (MT583814.1) الأكثر تشابه بنسبه وصلت الى 99.30%. تم إيداع هذا الجينوم الكامل لهذه السلالة في قاعدة بيانات NCBI-GenBank بالاسم Tomato yellow leaf curl virus – Mild strain Karbala-1 وتحت الرمز ON254272.1. إذ اشارت نتائج الفحص والتحليل عن عدم وجود ظاهرتي إعادة التركيب وإعادة التجميع في جينوم فايروس TYLCV-Mld Karbala-1 المشخص في هذه الدراسة علما ان المتجاورات المتداخلة لسلالة الفايروس هذه كانت السائدة في حقول الطماطة التي شملها المسح. ويعد هذا التسجيل الأول لهذا السلالة في محافظة كربلاء، العراق.
بينت النتائج أيضا عدم وجود مقروءات او متجاورات متداخلة شبيه للتابعين ألفا و دلتا بينما كان هنالك 12,712 مقروءة و9 متجاورات غطت بشكل تام (100%) الجينوم الكامل لأحد توابع بيتا (satDNA β) وهو Cotton leaf curl Gezira betasatellite isolate Al-Ain (KM279620.1) وبنسبة تشابه 94.66% والذي تم تأكيده بنتائج تحليل النشوء والتطور لذلك حفظ الجينوم الكامل لهذا التابع في مستوعب NCBI-GenBank بالاسم Cotton leaf curl Gezira betasatellite isolate Karbala وتحت الرمز ON206651.1 ويعد هذا التسجيل الأول لهذا التابع في العراق.
كما بينت النتائج ان هنالك العديد من المتجاورات المتداخلة التي تتشابه مع القطعتين الأولى والثانية (Segment A و Segment B) من جينوم الفايروس Tomato leaf curl palampur virus ذو الجينوم ثنائي الأجزاء (Bipartite). كما لوحظ ان هذه المتجاورات تمتلك تنظيماً جينياً مطابقاً لجينوم هذا الفايروس اذ احتوت القطعة الأولى (Segment A) على ستة جينات رئيسة مشفرة لبرويتنات ستة رئيسة للفايروس بينما تضمنت القطعة الثانية (Segment B) جينين فقط تشفران لبروتينين بالإضافة الى احتواء القطعتين على مناطق غير مشفرة مابين الجينات (Intergenic region). وبالرغم من تسجيل ودراسة الإصابة بهذا الفايروس سابقاً في العراق على نباتات القرع و الداتورة و الخيار الأ ان تشخيصنا له في نبات الطماطة هو الأول على مستوى العراق.
لقد تم أيضا في هذه الدراسة تشخيص جينوم فيروس داخلي ضمن جينوم نبات الطماطة Solanum lycopersicum. اذ أشارت نتائج التشابه لمسودة الجينوم التي تم الحصول عليها الى ان الفايروس المشخص هو Tobacco vein clearing virus (TVCV) وبنسبه تشابه 87.4% مع نسبة تغطية 98.1 % كما اكدت نتائج تحليل التشابه والنشوء هذا التشخيص وقد تم التجميع النهائي لتسلسل جينوم TVCV المشخص في هذه الدراسة وايداعه ضمن بيانات بنك الجينات تحت الرمز ON684329 اذ كان ذو شريط DNA مزدوج طوله 7760 قاعدة نايتروجينية تتضمن أربعة أطر قراءة مفتوحة open reading frames أي جينات تشفر المناطق المحافظة النموذجية لجينوم أنواع الجنس Solendovirus التابع لها.
بالإضافة الى ذلك فقط تم الحصول على مسودة الجينوم الكامل لمايتوكوندريا حشرة الذبابة البيضاء المرافقة لنباتات الطماطة المصابة وذلك عن طريق تحديد وجود 14 جين مشفر للبروتينات Protein-coding genes (PCGs) مع وجود جينين للحامض النووي الرايبوسومي Ribosomal RNA genes للوحدة الكبيرة والصغيرة و22 جين من الحامض النووي الناقل Transfer RNA. واكدت هذه النتيجة ان نوع حشرة الذبابة البيضاء المنتشرة على محصول الطماطة في محافظة كربلاء هو Bemisia tabaci MEAM1. وأظهرت نتائج التشخيص الجزيئي باستعمال تفاعل البلمرة المتسلسل اللحظي Real Time-PCR ان البادرات الناميه من البذور المعقمة والبذور غير المعقمة كانت مصابة بالفايروس TYLCV مما يشير الى إمكانية انتقال هذا الفايروس بواسطة البذور.